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應(yīng)用差速離心法分離外泌體的原理

更新時(shí)間:2023-01-31點(diǎn)擊次數(shù):1721

外泌體是一種小的 (40-100 nm) 細(xì)胞外膜囊泡,目前進(jìn)行外泌體分離的普遍方法是差速離心法

     應(yīng)用差速離心法和粒徑分析等是細(xì)胞外囊泡 (EV) 研究的重要步驟。已知細(xì)胞會(huì)分泌許多膜囊泡,這些囊泡的大小、分子含量及其形成機(jī)制各不相同 具體取決于細(xì)胞的類型 和當(dāng)前狀態(tài)。通常可以辨別出三個(gè)主要的 EV 群體:凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體  . 凋亡小體是已知較大的囊泡,直徑為 800-5000 nm,由凋亡后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細(xì)胞釋放。脫落的囊泡,也稱為“胞外體"或有時(shí)稱為“微泡",是由質(zhì)膜起泡產(chǎn)生的,一般的粒徑尺寸范圍為 (50– 1000 nm)

   外泌體是內(nèi)吞起源的小 (40–100 nm) 囊泡群。外泌體和脫落的囊泡都含有特定的蛋白質(zhì)組、RNA , dsDNA 等。不同的細(xì)胞外環(huán)境富含不同類型的細(xì)胞外囊泡。即使由相同的細(xì)胞類型形成,不同類別的囊泡也具有不同的核酸特征  

差速離心法的原理

離心管內(nèi)粒子的速度,由三種力(離心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力)的平衡決定,如:

公式

其中g(shù)eff為離心力(加速度),R為旋轉(zhuǎn)半徑,即粒子距旋轉(zhuǎn)軸的距離,ω為旋轉(zhuǎn)角頻率,d為粒子直徑,ρ為質(zhì)量粒子的密度和 ρ solv和 η 分別是介質(zhì)的密度和粘度。

    在固定的離心條件(轉(zhuǎn)速和介質(zhì)成分)下,粒子速度由粒子的形態(tài)和密度決定。密度高于介質(zhì)密度的粒子沿離心力“向下"運(yùn)動(dòng),而比介質(zhì)輕的粒子沿與離心力相反的方向“上浮"。對(duì)于相似的密度,較大的粒子遷移得更快。因此,在生物學(xué)中,離心主要用于按大小(差速和速率區(qū)帶離心)或按密度(等密度離心)分離不同的物體。在這項(xiàng)研究中,我們專注于使用差速離心按大小進(jìn)行顆粒分級(jí)。

       與等密度和梯度離心相反,差速離心從離心管內(nèi)顆粒的均勻初始分布開始。在開始一輪離心過程中,位于管底部附近的一部分目標(biāo)小顆粒不可避免地與較大顆粒共同沉淀。這種共沉淀導(dǎo)致較小顆粒的產(chǎn)量降低。然而,選擇大顆粒,起初位于管半月板附近,在開始一輪離心過程中可能沒有足夠的時(shí)間到達(dá)管底,從而污染最后一個(gè)離心步驟產(chǎn)生的小顆粒顆粒。

       顯然,交叉污染的程度取決于不同粒子群的相對(duì)沉降速度和離心條件。在被分離的粒子的沉降速度之間存在顯著(數(shù)量級(jí))差異的情況下,可以有效地優(yōu)化差速離心協(xié)議以獲得目標(biāo)粒子群的高產(chǎn)量和足夠純度。此外,當(dāng)不同顆粒部分之間的沉降速率僅存在微小差異時(shí),優(yōu)化過程不太成功。在這些情況下,取決于離心條件。

       任何外泌體分離方案旨在獲得產(chǎn)量合理且不受細(xì)胞碎片、細(xì)胞器和凋亡小體污染的外泌體群體,理想情況下,不含其他類型的細(xì)胞外囊泡、蛋白質(zhì)及其聚集體。由于大小差異很大,將外泌體與細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡分離相對(duì)容易。巨大的挑戰(zhàn)是從小的脫落囊泡中純化外泌體,因?yàn)樗鼈兊拇笮》浅O嗨啤Mㄟ^差速離心分離這些細(xì)胞外囊泡既困難又低效。所以需要根據(jù)轉(zhuǎn)子的特性和要分離的顆粒的特性,來(lái)對(duì)離心參數(shù)應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。因?yàn)殡x心速度與粒子的旋轉(zhuǎn)半徑成正比,所以離心運(yùn)動(dòng)加速。粒子的徑向坐標(biāo)隨時(shí)間t呈指數(shù)增長(zhǎng)。

離心機(jī)轉(zhuǎn)子的選擇

    使用差速離心法分離外泌體主要需要注意的是轉(zhuǎn)子的選擇。“擺動(dòng)桶"(SW) 轉(zhuǎn)子和“定角"(FA) 轉(zhuǎn)子, 這些轉(zhuǎn)子的幾何形狀根本不同,因此沉降特性也不同。這些轉(zhuǎn)子之間的主要區(qū)別在于: FA 轉(zhuǎn)子,與旋轉(zhuǎn)半徑相比,沉積顆粒的較大路徑長(zhǎng)度通常較小,允許近似恒定遷移率并簡(jiǎn)化描述。然而,第二個(gè)區(qū)別是圓形 FA 管的水平橫截面是橢圓形的,不同粒子的路徑長(zhǎng)度根據(jù)軌跡與橢圓長(zhǎng)軸的距離而不同。由于較短的路徑長(zhǎng)度,外圍顆粒可能沉降得更快,需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。

蘇州阿爾法生物提供的超速離心機(jī)、低速離心機(jī)、落地式離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、納米粒徑分析儀廣泛應(yīng)用于差速離心法分離外泌體及外泌體形態(tài)、電位、粒徑分析等實(shí)驗(yàn)。

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