一、載體與質粒的基本定義

1. 載體（Vector）

   指通過重組 DNA 技術，將有用的目的 DNA 片段送入受體細胞進行繁殖和表達的工具，細菌質粒是其中常用類型。
2. 質粒（Plasmid）的基本特征

• 結構：染色體外的雙鏈、閉環 DNA 分子，大小 1-200kb，以超螺旋狀態存在于宿主細胞。

• 存在范圍：主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中。

• 功能：具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定拷貝數并表達遺傳信息。

• 宿主依賴：復制和轉錄需依賴宿主細胞的酶和蛋白質，離開宿主無法存活；但宿主無質粒也可正常存活。

• 天然質粒舉例：F 質粒（F 因子 / 性質粒）、R 質粒（抗藥性因子）、Col 質粒（產大腸桿菌素因子）。

二、質粒的關鍵特性

1. 質粒的復制類型

2. 質粒的不相容性（Incompatibility）

• 同一復制系統的不同質粒：無法在同一宿主細胞共存，因復制和分配時競爭，幾代后少數質粒會丟失，僅存一種。

• 不同復制系統的質粒：可在同一宿主細胞中穩定共存。

3. 質粒的表型特征

• 對抗生素的抗性；

• 產生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素；

• 降解復雜有機物；

• 編碼限制性內切酶與修飾酶。

三、質粒載體的構建與理想特性

1. 質粒載體的構建（基于天然質粒改造）

• 保留核心功能：人工添加 1 個及以上選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）、含多個限制性內切酶識別位點的 多克隆位點序列。

• 簡化結構：去除大部分非必需序列，減小分子量，便于基因工程操作。

• 輔助序列：攜帶多用途序列，如肉眼鑒定重組克隆、產生單鏈 DNA（用于測序）、體外轉錄外源 DNA、鑒定片段插入方向、外源基因大量表達。

2. 理想克隆載體的特性

1. 分子量小、多拷貝、松弛控制型；

2. 具有多種常用限制性內切酶的單切點；

3. 能插入較大的外源 DNA 片段；

4. 具有易操作的檢測表型。

3. 常用質粒載體

大小多為 1-10kb，如 pBR322、pUC 系列、pGEM 系列、pBluescript（pBS）。

四、細菌質粒 DNA 的分離與存在形式

1. 分離的 3 個基本步驟

1. 培養細菌：使質粒擴增；

2. 裂解細胞：用溶菌酶破壞細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）或 Triton X-100 裂解細胞膜；

3. 分離純化：

• 染色體 DNA：纏繞于細胞碎片，因分子大易斷裂為線性片段，經熱 / 酸 / 堿處理后變性，難以復性；

• 質粒 DNA（共價閉合環狀 DNA，cccDNA）：變性后可復性，以超螺旋形式溶于液相。

2. 質粒 DNA 的 3 種存在形式

• 超螺旋 DNA：天然狀態，共價閉環，電泳泳動速度最快；

• 開環 DNA（ocDNA）：一條鏈一處或多處斷裂，形成松弛環狀；

• 線狀 DNA（Linear DNA）：兩條鏈在同一處斷裂，電泳泳動速度最慢。